反相色譜柱的清洗和再生方法

 反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用*泛的技術(shù)，主要是因為它適用于分析極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜的固定相本質(zhì)上都是疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小程度來分離的，樣品基體中其它疏水雜質(zhì)組分也能以同樣的方式保留。

除C18、C8、C4、C2、C1、CN、NH2和Phenyl等常見的一些鍵合硅膠固定相外，還有幾個分支品種，如混合相固定相（例如苯基－己基）、封尾和未封尾的填料種類以及極性嵌入固定相等。還有其它很多填料也用于反相色譜，包括聚合物、聚合物包覆硅膠和聚合物包覆氧化鋁、無機－有機雜化物、涂覆氧化鋯和石墨化碳等。不同的固定相分別都有自己的優(yōu)點和缺點。

反相色譜柱通過調(diào)節(jié)流動相組成的變化和添加一些試劑的方式，成功實現(xiàn)了許許多多不同的色譜應(yīng)用。一些技術(shù)是利用添加劑改變了填料的表面特性，有時候這些添加劑本身有可能會污染硅膠和鍵合相表面。

硅膠表面除了有疏水鍵合相外，還有別的一些化學(xué)特性。殘留的硅醇基存在于所有的硅膠鍵合填料中。這些硅醇基具有弱酸性，因此能與某些待分析物和樣品基體中的雜質(zhì)相互作用，特別 是堿性物質(zhì)發(fā)生作用。因為硅醇基的pKa值大約是4.5，離子化能在中性pH條件下發(fā)生，而存在與陽離子產(chǎn)生靜電相互作用的可能。較老的A型硅膠含有高濃度金屬雜質(zhì)離子（有時候達(dá)100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大，甚至能與某些金屬鰲合化合物發(fā)生作用。殘留硅醇基在非末封尾的鍵合硅膠表面和在C2或C4等短鏈硅膠鍵合相填料中，麻煩更大。

必須清楚地了解所用固定相的表面特性和可能存在的分析物－固定相表面的相互作用模式，這樣當(dāng)用反相色譜方法時才能充分考慮到潛在的樣品基質(zhì)污染的影響。例如， 疏水性非常強的樣品基質(zhì)如玉米油、高芳香物質(zhì)和蠟?zāi)苷吃诜聪嗵盍系谋砻娌⑶腋淖儽砻嫘再|(zhì)。含有類蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物質(zhì)樣品也能吸附在填料表面。盡管分析者想盡最大努 力來保護(hù)HPLC柱子免受外源物質(zhì)的污染，但某些分析物－樣品基體的結(jié)合作用最終會使固定相受到污染。

當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會有些不同。被污染的反相色譜柱會產(chǎn)生反壓問題，必須進(jìn)行清洗和再生才能恢復(fù)到原來或接近原來的狀態(tài)，本文將提出了一些切實可行的恢復(fù)方案供大家討論或參考。著重點在鍵合硅膠柱上，其它類型的反相柱的清潔和再生步驟最后也有介紹。

什么原因導(dǎo)致污染物在反相柱上的聚集？

通常，樣品基體中會含有一些對分析者來說不感興趣的東西，如鹽、脂類、含脂物質(zhì)、腐殖酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物質(zhì)，是一些可能與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)和目標(biāo)分析物比，保留能力有些強，有些弱。那些保留能力小的雜質(zhì)，如鹽類，通常在死體積處就會被洗脫出來，在譜圖上表現(xiàn)為干擾峰、小斑點、基線擾動、甚至是倒峰等等。而樣品基體中的強保留物質(zhì)，如果流動相的洗脫能力從來沒有調(diào)高到足以把它們洗脫出來，多次上樣后，它們就會在柱頭累積。這種現(xiàn)象通常在等度洗脫時容易觀察到。保留能力中等的雜質(zhì)能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為 寬峰、基線擾動或者基線漂移。
有時，這些被吸附的雜質(zhì)累積到雜質(zhì)本身足以作為一種新固定相的程度。分析物能與這些雜質(zhì)作用，起一定的分離作用。此時保留時間會發(fā)生漂移，并出現(xiàn)峰形拖尾。如果污染程度再嚴(yán)重下去，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，依照發(fā)生堵塞的位置不同，可使柱子無法工作或使柱頭塌陷產(chǎn)生空洞。

硅膠基質(zhì)鍵合反相柱的清洗

再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砣コＨ绻廴臼且驗橹貜?fù)進(jìn)樣時強保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡單的清洗步驟來除去這些污染物往往就能恢復(fù)其色譜性能。

經(jīng)過等度運行后的色譜柱，有時用90～100％含量的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中洗脫能力較強的溶劑，如甲醇、乙晴、四氫 呋喃等）沖洗20個柱體積可以清除污染物（色譜柱的柱體積和空柱管體積概念不同，一根4.6x250mm柱子的柱體積只有2.5ml，2.1x150mm的是0.28ml）。

如果使用的是緩沖鹽系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖鹽沉淀，這樣會導(dǎo)致更大的問題，如柱頭篩板堵塞、連接管路堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖鹽流動相（即把緩沖液換成水），沖洗5～10個柱體積以后才切換到用強溶劑清洗。
有時候，強溶劑B也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要用更強的溶劑或者是系列溶劑組合。如果污染物不是生物質(zhì)的，一種強溶劑或幾種溶劑組合清洗基本能解決問題。柱子生產(chǎn)廠家的網(wǎng)頁和產(chǎn)品說明書上很多也有清洗方法推薦。
所有的清洗方法的模式普遍都類似，溶劑系列中所用溶劑的強度逐級增加，最后一個溶劑往往是非極性（疏水性）很強的（如醋酸乙酯甚至是烷烴），以便于溶解脂質(zhì)、油類等非極性污染物。溶劑系列中每個溶劑都保證能與下一個溶劑互溶。整個清洗過程結(jié)束后，在回到原來的流動相體系前，必須借助一個中等強度的互溶性非常好的溶劑過渡。例如， 異丙醇是一個非常好的過渡溶劑，它既能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。

還有，如果使用紫外檢測器，須避免選用在紫外區(qū)域有吸收的溶劑，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。
對于典型的硅膠基質(zhì)鍵合反相柱，在未使用緩沖溶液的條件下，推薦使用以下清洗溶劑系列：
      100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％異丙醇---100％異丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷
用每種溶劑沖洗至少10個柱體積，對于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動相體系（但不含緩沖鹽），最后回復(fù)到起始流動相配置。

四氫呋喃也是另外一種常用的清洗溶劑。如果懷疑柱子被嚴(yán)重污染，還可用二甲亞砜（DMSO）或 二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合，以低于0.5ml/min的流速沖洗色譜柱。

成功再生反相柱子是一個非常耗時的過程，溶劑沖洗序列可以編成一個梯度洗脫的程序自動進(jìn)行，以方便過夜操作。

清洗硅膠基質(zhì)鍵合反相柱上的蛋白質(zhì)殘留

如果是生物物質(zhì)如血漿或血清等積累在反相色譜柱上，必須采用稍不同的清洗方法。大部分情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質(zhì),就不能有效地清洗柱子。不過由有機溶劑和緩沖液、酸,有時還加上離子對試劑等組成的混合液能有用。開始可嘗試用高比例的的強溶劑（溶劑B）沖洗。

Freiser和他的合作者發(fā)現(xiàn):重復(fù)進(jìn)行梯度洗脫,可以再生被污染的反相柱子。Bhadwaj和Day認(rèn)為在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇就能起到效果。如果上述幾個方法都不成功，Cunico和他的同事推薦了幾種強溶劑或增溶劑可用來除去蛋白質(zhì)（見下所列）。

清洗溶劑                      組成

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醋酸                              1%水溶液

三氟醋酸                          1%水溶液

0.1%三氟醋酸水溶液/丙醇        40:60(v/v)(較粘,需降低流速)

TEA(三乙胺)/丙醇               40:60(v/v)(混合前用0.25N磷酸和三乙胺調(diào)pH到2.5)

脲或胍的水溶液                 5-8M(調(diào)pH到6-8)

氯化鈉、磷酸鈉或硫酸鈉溶液     0.5-1.0M（磷酸鈉pH7.0）

DMSO/水 或二甲基甲酰胺/水      50：50（v/v）                   

在使用這些清洗溶劑之前，可以先咨詢柱子的廠商確保這些溶劑不會對填料帶來損壞。硅膠基質(zhì)的柱子通常來說都是可以的，但某些洗滌溶劑的配方可能會使有機聚合物基質(zhì)的填料膨脹或收縮，從而影響其色譜性能。

須確保上表用的清洗溶劑能與先前用過的溶劑互溶，丙醇可以作為很好的過渡。對每個溶劑系統(tǒng)至少要沖洗20個柱體積。由于有些溶劑系統(tǒng)黏度很大，沖洗的流速應(yīng)該相應(yīng)調(diào)整以確保不會超過泵壓。用完胍或脲等溶劑清洗柱子后，至少應(yīng)該用40～50柱體積的HPLC級純水來沖洗。

對于反相柱子，不建議用表面活性劑如十二烷基磺酸鈉（SDS）和Trition，因為這些化合物必然會牢固吸附在硅膠鍵合相柱子上，很難除去。用表面活性劑會影響改變填料表面性質(zhì)。然而，Separation Group的研究表明:多肽合成產(chǎn)生的保護(hù)基和清除劑對柱子的污染，可以通過在流動相中加入500μL 1％SDS溶液以1ml/min的流速清洗掉。然后再用從5％～95％乙腈/1％（v/v）三氟醋酸的梯度洗脫，在起始條件平衡后，就可以恢復(fù)柱子的多肽分離功能。

清洗反相柱的特殊技巧 

有時用有機溶劑清洗污染柱子并不能成功，尤其是有金屬離子吸附在硅膠或鍵合相上時，這種情況下，可用鰲合劑如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）沖洗色譜柱，EDTA能與許多金屬離子絡(luò)合并溶解它們。用完EDTA溶液后，一定要用水充分沖洗柱子。如果樣品中含離子化合物，改變pH可以使它們轉(zhuǎn)為非離子狀態(tài)，這樣就可以被水/有機溶劑洗脫下來。例如，強堿性雜質(zhì)能在pH低于3時被除去，在這個條件下質(zhì)子銨變得水溶性更好。酸性雜質(zhì)能在pH調(diào)整到大于其pKa時被洗下來--大約時pH8或9，此時酸性雜質(zhì)處于離子狀態(tài)。然而，要注意硅膠柱子在長時間處于高pH條件下容易被破壞。

要避免緩沖液或用緩沖液保存的柱子長菌，可以用普通家用漂白劑1：10或1：20稀釋后來沖洗，50柱體積沖洗后，接著至少要用50柱體積色譜純的水沖洗。不能讓漂白水通過檢測器，因為漂白水會腐蝕檢測池。避免溶劑瓶中緩沖液長菌，每次只取足夠的緩沖液用，把沒用的保存在冰箱里，不能讓不流動的緩沖液在柱子中長期存在。

色譜工作者經(jīng)常會討論到離子對色譜中離子對試劑對固定相的影響。顯然離子對試劑如辛烷－磺酸（用于陽離子）和四烷基銨溴（用于陰離子）在一定濃度的有機修飾劑下能很強地吸附在硅膠鍵合柱子上，柱子因此被污染且很難回復(fù)到起始狀態(tài)。因此，一般認(rèn)為用過離子對試劑的柱子都應(yīng)該專用，而不能再當(dāng)常規(guī)的反相色譜柱用。

Bidlingmeyer不同意這種觀點，他認(rèn)為：離子對色譜所用的pH酸度或堿度很大，在酸性條件下（pH1-3）使鍵合相和封尾試劑水解，在高pH條件下（pH7-8）溶解硅膠基質(zhì)，因而使一些柱子的性能改變。要清除磺酸離子對試劑，他建議首先用原先的流動相（僅少了離子對試劑）至少沖洗20柱體積，然后用無緩沖液的流動相沖洗(在這個清洗步驟中，甲醇可能比乙晴更有效；如果是長鏈的離子對試劑，則用四氫呋喃)。很明顯，磺酸離子對試劑和銨離子對試劑有著不同的表現(xiàn)。Bidlingmeyer和他的合作者證明了：在C18柱子上用甲醇比例超過70%的流動相，長鏈離子對試劑，如SDS不會吸附在固定相上。這個發(fā)現(xiàn)跟Separation Group的結(jié)果一致。

硅膠鍵合整體柱如Chromolith 柱子（德國默克公司產(chǎn)品），清洗時可跟別的硅膠柱一樣處理。